使用AmpliScribe™高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒可
能zui高產(chǎn)量的持續(xù)制備RNA

Judith T. Schanke, EPICENTRE Technologies

介紹：
      使用嗜菌體RNA多聚酶體外轉(zhuǎn)錄DNA模板是普遍使用的產(chǎn)生特異RNA轉(zhuǎn)錄本的有效方法。嗜菌體RNA多聚酶從特異的嗜菌體啟動子控制下的克隆的線性DNA模板合成RNA。體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA廣泛地用于包括體外翻譯，核酶合成1，剪切及加工研究，結(jié)構(gòu)鑒定以及制備非放射性RNA探針2-4。通過轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄本還可以以顯微注射的方式導(dǎo)入細(xì)胞5進(jìn)行反應(yīng)實驗，或用于RNA的細(xì)胞定位4。
      EPICETRE公司的AmpliScribeäT7，T3和SP6高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒使用高濃度的NTPs（抑制其它試劑盒和其它傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)），能zui大可能地產(chǎn)生大小范圍從25堿基到數(shù)千堿基的RNA轉(zhuǎn)錄本6。使用AmpliScribeT7RNA轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以從每微克DNA模板產(chǎn)生多至150微克的高質(zhì)量，全長（1.4kb）的RNA轉(zhuǎn)錄本。在此，從體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品的產(chǎn)量或及RNA的完整性兩方面，將AmpliScribeT7轉(zhuǎn)錄試劑盒與傳統(tǒng)的T7RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系7及另兩個供應(yīng)商的類似試劑盒相比較。
 

材料與方法：

• DNA模板的制備
      線性DNA模板以限制性內(nèi)切酶酶切質(zhì)粒DNA產(chǎn)生。消化后的DNA以200µg/ml蛋白酶K和0.5%SDS，50°C處理30分鐘zui大限度地減少核酸酶污染。酚/氯仿法抽提后乙醇沉淀純化質(zhì)粒，再以TE重懸。AmpliScribe線性對照DNA由試劑盒提供。
• 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
      AmpliScribeT7轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按試劑盒提供的方法進(jìn)行。20µl反應(yīng)體系中含1×反應(yīng)緩沖液，10mM DTT，7.5mM NTPs，1µg線性DNA模板，2µl AmpliScribeT7酶溶液，37°C反應(yīng)2小時。用其它廠商試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時按試劑盒提供的方法進(jìn)行。每20µl反應(yīng)體系中含1µg線性DNA模板，37°C反應(yīng)2小時。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系含10UT7 RNA多聚酶，0.5mM NTPs，1×轉(zhuǎn)錄緩沖液及10mM DTT7。
• RNA定量和完整性分析
      加入等體積冷5M醋酸銨終止轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，樣品冰上放置10分鐘，zui大速度離心10分鐘沉淀RNA。光譜測定法定量，使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行非變性瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性。

結(jié)果與討論：
      與傳統(tǒng)方法相比，AmpliScribe高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒能產(chǎn)生20倍以上的RNA。使用AmpliScribeT7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒和傳統(tǒng)T7RNA多聚酶反應(yīng)定時轉(zhuǎn)錄以制備1.4kb的轉(zhuǎn)錄本。37°C反應(yīng)2小時，醋酸銨沉淀法終止反應(yīng)。光譜分析測定RNA產(chǎn)量。使用AmpliScribeT7轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以較傳統(tǒng)反應(yīng)多產(chǎn)生20被以上的全長RNA轉(zhuǎn)錄本。

• AmpliScribeT7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒持續(xù)地產(chǎn)生zui大產(chǎn)量的RNA。
      比較AmpliScribeT7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒和另兩個供應(yīng)商的高產(chǎn)量試劑盒以生產(chǎn)商推薦的方法對從63堿基到2.6kb長度的三個線性DNA模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)2小時。AmpliScribeT7試劑盒較另兩個高產(chǎn)量試劑盒持續(xù)產(chǎn)生更多的轉(zhuǎn)錄本。
• AmpliScribeT7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒有更高的短RNA（<300堿基）產(chǎn)生
      產(chǎn)生大量的短RNA轉(zhuǎn)錄本較標(biāo)準(zhǔn)模板要有更多的起始事件。使用AmpliScribeT7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒能較另兩個供應(yīng)商A和P的試劑盒產(chǎn)生更多的短轉(zhuǎn)錄本。供應(yīng)商A的T7轉(zhuǎn)錄試劑盒也是特為產(chǎn)生短RNA（<300堿基）的。為了與此“段轉(zhuǎn)錄”試劑盒進(jìn)行比較，進(jìn)行了比較反應(yīng)。
   

    結(jié)果表明AmpliScribe試劑盒能較供應(yīng)商A的短模板轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)生更多的63堿基轉(zhuǎn)錄本。以標(biāo)準(zhǔn)2小時反應(yīng)，AmpliScribe轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的RNA是其它系統(tǒng)的兩倍、延長反應(yīng)時間至6小時，產(chǎn)生的RNA量則為供應(yīng)商A的試劑盒產(chǎn)量的4倍之多。盡管產(chǎn)生的段RNA微克數(shù)較1kb以上的RNA量少，但短RNA的分子數(shù)則大于1kb以上的RNA。反應(yīng)6小時后可以觀察到A供應(yīng)商的試劑盒產(chǎn)生的RNA有降解現(xiàn)象，而AmpliScribe試劑盒可以持續(xù)增加全長RNA轉(zhuǎn)錄本。

• AmpliScribeT7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒產(chǎn)生完整性好的RNA
      理想的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)應(yīng)該產(chǎn)生全長的完整RNA轉(zhuǎn)錄本。為了比較產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄本的完整性，AmpliScribeT7試劑盒與另兩個供應(yīng)商A和P的高產(chǎn)量試劑盒產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行了瓊脂糖凝膠電泳分析。所有被測的試劑盒均產(chǎn)生高質(zhì)量，全長的1.8kbRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在時間曲線實驗中，AmpliScribeT7試劑盒產(chǎn)生的1.4kb轉(zhuǎn)錄本的完整性在2，4，6小時時間點上進(jìn)行檢測，證明在所有時間點均產(chǎn)生高質(zhì)量的全長RNA。

總結(jié)：
    AmpliScribeT7高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄試劑盒持續(xù)性產(chǎn)生的RNA產(chǎn)量可能是當(dāng)前已有體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中產(chǎn)量zui高的。它能地以廣域的DNA為模板，重復(fù)性合成大量的全長RNA。

參考文獻(xiàn)：
1. Hoffman, L. and Johnson, M. （1994） BioTechniques 17, 372.
2. 1995 Epicentre Forum 2（5）, 4.
3. Kaplan, E. D., et al. （1996） Epicentre Forum 3（2）, 1.
4. Pederson, T. （1999） EASEBJ Suppl. 2, S238.
5. De Wit, T. et al. （1998） Nucl. Acids Res. 26（2）, 676.
6. 1996 Epicentre Forum 3（1）, 6.
7. Melton, D. Et al. （1984） Nucl. Acids Res. 12, 7035.